Nuovi passi avanti nella creazione di biosensori per la detection di SARS-COV-2

La pandemia che stiamo vivendo, causata dal Coronavirus SARS-CoV2 (ne abbiamo ampiamente parlato qui) e che porta alla malattia respiratoria COVID-19, rappresenta la terza pandemia su larga scala causata dai Coronavirus negli ultimi due decenni dopo la sindrome respiratoria acuta grave (SARS) nel 2003 e la sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) nel 2012. In una situazione in cui ci sono centinaia di migliaia di morti, senza dubbio l'identificazione rapida e accurata dell’agente infettivo può contribuire notevolmente a controllare una pandemia emergente. Ad oggi ottenere una diagnosi di laboratorio affidabile è stata una delle principali priorità per la promozione della prevenzione e del controllo delle epidemie.

Il metodo molecolare utilizzato per la rilevazione del virus è la rRT-PCR e l’Organizzazione mondiale della Sanità ha pubblicato l’elenco di diversi saggi molecolari basati su questa tecnica. I target genici per i saggi molecolari rRT-PCR selezionati da diversi Paesi sono simili, tra cui la sequenza RNA-polimerasi RNA-dipendente (RdRp) e la sequenza di lettura aperta 1ab (ORF1ab) (ne abbiamo parlato qui).

Nonostante la rRT-PCR sia una tecnica altamente specifica e sensibile, a volte i test rRT-PCR per il rilevamento di SARS-CoV2 hanno riportato risultati falsi negativi su casi di infezione confermati [1]. I risultati falsi negativi possono presentarsi per diverse ragioni, sia tecniche (ad es. tampone mal eseguito, problemi di estrazione dell'RNA, etc), sia cliniche (tampone eseguito in fasi dell'infezione in cui il numero delle particelle virali è troppo basso per rilevarne la presenza). Pertanto, è vantaggioso sviluppare altri sistemi diagnostici affidabili, che siano o meno complementari alla rRT-PCR.

I biosensori sembrano una tecnologia adatta a fornire una soluzione alternativa affidabile per diagnosi clinica, rilevazione in tempo reale e monitoraggio continuo

Cosa sono i biosensori?
I biosensori sono dei sistemi analitici che servono per rivelare una molecola (analita) attraverso l’ausilio di una componente biologica (biorecettore) accoppiata ad un trasduttore chimico-fisico (sensore), dove per trasduttore si intende un sistema chimico fisico in grado di convertire un segnale fisico di input in un'altra grandezza fisica di output (Fig.1).

Fig.1 Schema di un biosensore.

Riportiamo qui due studi relativi a due tipi di biosensori diversi.

PRIMO STUDIO: BIOSENSORE LSPR E PPT
Il gruppo di Jing Wang di Zurigo ha pubblicato un lavoro [2] in cui propone una tecnologia in cui vengono combinati due fenomeni: effetto ottico ed effetto termico. Il sistema si basa su un sensore costituito da una superficie di vetro ricoperta da un sottile strato (nano-film) di oro sulla quale si legano dei tioli (composti chimici contenenti carbonio, idrogeno e zolfo) a cui sono attaccate delle sequenze geniche artificiali in grado di riconoscere in modo specifico i geni del SARS-CoV2 (Fig.2). Se il materiale genetico del virus si lega alle sequenze geniche artificiali si conferma la presenza del virus nel campione analizzato tramite un fenomeno ottico.
Il fenomeno ottico sfruttato è quello della risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR): quando le molecole del virus legano in modo specifico i recettori sulla superficie d’oro, essi modulano la loro luminosità che viene rilevata da un sensore. L’effetto termico fa riferimento al l’effetto fototermico plasmonico (PPT): il calore generato aumenta l’affidabilità del sensore perché grazie a processi chimici permette di selezionare e identificare il genoma del Coronavirus in modo specifico.
L’effetto termico sfrutta il principio di ibridazione DNA-RNA; tecnica alla base di rRT-PCR e in vari sensori biomedici.

Che cos'è l'ibridazione DNA-RNA?
DNA ed RNA sono formati da filamenti a loro volta costituiti da nucleotidi legati l'uno all'altro. Ciascun nucleotide è uno zucchero legato a una base azotata tra le quattro possibili: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) se si tratta di DNA o uracile (U) se si tratta di RNA. Le basi presenti su due diversi filamenti di acido nucleico possono appaiarsi secondo il principio di complementarietà (ed è così che il DNA forma la caratteristica doppia elica). Ovvero A sarà sempre legata a T (o U se si tratta di RNA) e G a C.
L'ibridazione degli acidi nucleici consiste proprio nell'appaiamento di due diversi filamenti di RNA-DNA basandosi sul criterio dell'interazione specifica (principio di complementarietà). L'appaiamento di un filamento di acido nucleico con il suo filamento complementare porta alla formazione di un doppio filamento. Il processo inverso, mediante il quale un doppio filamento si divide nei singoli filamenti, si chiama fusione.

Due filamenti complementari possono ibridarsi in modo specifico tra loro quando la temperatura è leggermente inferiore alla loro temperatura di fusione. A temperature più basse aumentano le ibridazioni aspecifiche, mentre aumentando il calore (fino alla temperatura di fusione) invece aumenta la selettività. Questo è esattamente l'effetto PPT generato dall'aumento della temperatura ambiente.
In questo lavoro viene quindi descritto un unico sensore che però sfrutta due angoli di incidenza diversi, le risonanze plasmoniche di PPT e LSPR che possono essere eccitate a due diverse lunghezze d'onda, il che ha migliorato significativamente la stabilità, la sensibilità e l'affidabilità del rilevamento. Con questa configurazione, l'unità di rilevamento LSPR ha ottenuto un rilevamento in tempo reale e label-free delle sequenze virali (tra cui RdRp-COVID, ORF1ab-COVID e geni E da SARS-Cov-2).
Questo tipo di biosensore presenta un'alta sensibilità verso le sequenze SARS-CoV-2 selezionate ed ha come limite di rilevazione la concentrazione del DNA virale di 0,22 pM, consentendo il rilevamento preciso del target specifico in una miscela di più geni.
Ad oggi, comunque, il sistema va ancora perfezionato e non è ancora disponibile come test alternativo.

Fig.2 Illustrazione schematica del biosensore. A. Funzionalizzazione del nanofilm di oro basata sulla reazione con ligandi tiol-cDNA; B. Ibridazione di due filamenti complementari; C. Ibridazione inibita di due sequenze parzialmente abbinate. Le frecce blu indicavano le basi non corrispondenti di RdRp-SARS e cDNA funzionalizzato di RdRp-COVID.

Che cos’è LSPR?
LSPR è l’acronimo che sta per Risonanza Plasmonica di Superficie Localizzata e rappresenta una metodica spesso utilizzata per misurare interazioni molecolari in tempo reale. Si basa sul cambiamento dell’indice di rifrazione (una grandezza adimensionale che quantifica la diminuzione della velocità di propagazione della radiazione elettromagnetica quando attraversa un materiale) sulla superficie di un sensore, provocato da un’alterazione dovuta al legame tra due molecole che interagiscono

Cos’è il PPT?
PPT sta per Effetto Fototermico Plasmonico ed è una metodica che comporta la rapida conversione della luce in calore, da parte di nanoparticelle plasmoniche

SECONDO STUDIO: BIOSENSORE FET
Un gruppo di ricercatori coordinati dai professori Edmond Changkyun Park e Seung Il Kim propone in un lavoro [3], pubblicato a metà aprile, un biosensore basato sul FET per rilevare SARS-CoV2 direttamente dal tampone rino-faringeo, senza necessità di trattare il campione biologico prima di analizzarlo come avviene per i metodi tradizionali.

FET sta per Transistor a Effetto di Campo e si tratta di un dispositivo a semiconduttore largamente usato in elettronica. Tra i molti metodi diagnostici attualmente disponibili, i dispositivi di biosensing basati su FET presentano numerosi vantaggi, tra cui la possibilità di effettuare misurazioni altamente sensibili e istantanee utilizzando piccole quantità di campione nell’analisi.Uno degli elementi chiave del biosensore è il grafene: materiale costituito da uno strato monoatomico di atomi di carbonio disposti a esagono. Il grafene è un materiale molto utile per il rilevamento grazie alle sue straordinarie proprietà elettrochimiche, tra cui l'elevata conducibilità elettronica, mobilità del trasportatore e un'ampia area specifica. I biosensori FET a base di grafene sono in grado di rilevare i cambiamenti sulla loro superficie e fornire un ambiente ottimale per il rilevamento ultrasensibile.

Il sensore presentato nello studio è stato prodotto immobilizzando l'anticorpo per la proteina Spike SARS-CoV2 ai fogli di grafene di cui è costituito il FET. Quando l'anticorpo immobilizzato lega la proteina Spike del Coronavirus, che indica la positività del campione e dunque la presenza dell'infezione, avviene un cambiamento nella corrente elettrica. Questi cambiamenti elettrici sono misurati da un analizzatore di semiconduttori e da una stazione di sonda. La sensibilità arriva a rilevare fino 1 fg/ml (femtogrammo/millilitro, 10-15 gr/ml) di virus.

Ricordiamo che la proteina Spike del virus è quella che si lega al recettore ACE2 delle cellule umane, gli permette di attraversare la membrana cellulare e entrare all'interno, iniziando l'infezione ne abbiamo parlato qui).

Ciò nonostante, allo stato attuale dello sviluppo, il test risulta meno sensibile rispetto alla tradizionale rRT-PCR, e dovrà essere ulteriormente perfezionato prima dell'eventuale immissione in commercio.


REFERENZE

1. Xie X, Zhong Z, Zhao W, Zheng C, Wang F, Liu J. Chest CT for Typical 2019-nCoV Pneumonia: Relationship to Negative RT-PCR Testing. Radiology. February 2020:200343. doi:10.1148/radiol.2020200343
2. Qiu G, Gai Z, Tao Y, Schmitt J, Kullak-ublick GA, Wang J. Dual-Functional Plasmonic Photothermal Biosensors for Highly Accurate Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Detection. 2020. doi:10.1021/acsnano.0c02439
3. Seo G, Lee G, Kim MJ, et al. Rapid Detection of COVID-19 Causative Virus (SARS-CoV-2) in Human Nasopharyngeal Swab Specimens Using Field-E ff ect Transistor- Based Biosensor. 2020. doi:10.1021/acsnano.0c02823