COME SI CONFERMA LA DIAGNOSI DI COVID-19

IL LABORATORIO

Merita un approfondimento anche il metodo con cui viene confermata la diagnosi di COVID-19.

Prima cosa da precisare è che i laboratori che effettuano i test per il virus SARS-CoV2 devono rispettare rigorosamente le appropriate pratiche di biosicurezza.

Cos’è la biosicurezza?

Il termine biosicurezza indica l’insieme delle norme, tecnologie e pratiche di contenimento che sono realizzate per prevenire esposizioni involontarie o fuoriuscite accidentali di agenti patogeni e tossine. Esistono 4 livelli di biosicurezza e sono riassunti in Tabella 1.

Tabella 1 - Livelli di Biosicurezza nei laboratori

TAMPONE E rRT-PCR

La diagnosi molecolare per COVID-19 è effettuata a partire da un campione di cellule prelevate dall’apparato respiratorio, in particolare dalla faringe. Sebbene sembra sia possibile rilevare la presenza del virus in altri tipi di campioni come feci e sangue, quelli respiratori offrono la massima resa [1-3].

In questi giorni si è molto parlato dei tamponi effettuati sulle persone sintomatiche o su quelle venute in diretto contatto con individui già risultati positivi al virus.

Cos’è un tampone?

Un tampone è un lungo bastoncino cotonato con il quale l’operatore sanitario preleva un po' di mucosa faringea. Una volta effettuato il prelievo, il tampone è inserito in una provetta contenente un liquido per la conservazione e il trasporto del campione prelevato.

Dal tampone viene estratto il materiale genetico (RNA) sul quale verrà poi effettuata l’indagine molecolare.

L’RNA estratto viene utilizzato per effettuare una Real Time PCR preceduta da uno step di retrotrascrizione (rRT-PCR).

Cosa sono la retrotrascrizione e la Real Time PCR?

La retrotrascrizione (RT) è un processo biologico, che può essere realizzato in laboratorio, che consiste nel trascrivere una molecola di RNA in una di DNA.

La PCR (Polymerase Chain Reaction, in italiano «reazione a catena della polimerasi») è una tecnica che viene ampiamente utilizzata nella diagnostica molecolare e che consiste nell’amplificazione di specifiche porzioni di materiale genetico. La polimerasi è l’enzima che unisce tra loro i nucleotidi che formano la molecola di acido nucleico.

Amplificare una sequenza genetica vuol dire crearne un altissimo numero di copie, in modo da renderla rilevabile dallo strumento e poterla qualificare e quantificare.

La Real Time PCR (in italiano PCR in tempo reale) è una tecnica molto sensibile, che consente di seguire passo passo il processo di amplificazione che lo strumento sta eseguendo.

 Quando la Real Time PCR è preceduta da uno step di retrotrascrizione, si parla di rRT-PCR (Fig.6).

Fig.6 – Schema della RT-PCR. Il DNA ottenuto con la RT, viene poi amplificato in una serie di cicli successivi di PCR, durante i quali il numero di molecole di DNA raddoppia ad ogni ciclo

rRT-PCR

Per la diagnosi molecolare, quindi, si cercano sequenze specifiche dell’RNA virale nell’RNA estratto dalle cellule del paziente (prelevate col tampone faringeo).

Estraendo l’RNA dalle cellule del paziente ed effettuando la rRT-PCR ci si potrà trovare di fronte a tre casi:

1. viene rilevato il materiale genetico virale, quindi nelle cellule da cui è stato estratto l’RNA c’era sia l’RNA del paziente sia quello del virus, perciò egli è infetto;
2. non viene rilevato il materiale genetico virale, quindi nelle cellule da cui è stato estratto l’RNA c’era solo l’RNA del paziente, perciò egli è sano;
3. si ottiene un risultato negativo da un paziente con un alto indice di sospetto per l'infezione; perciò è preferibile raccogliere e testare campioni aggiuntivi e, se possibile, prelevati dal tratto respiratorio inferiore [4].

Con la pubblicazione della sequenza genetica di SARS-CoV2 si sono potuti allestire i test diagnostici da effettuare con rRT-PCR. Durante un'emergenza di sanità pubblica, i laboratori diagnostici possono fare affidamento su questa tecnologia robusta e sensibile per ottimizzare nuovi protocolli diagnostici a partire da quelli utilizzati nella routine, prima che siano disponibili i test commerciali pre-formulati e validati.

Diversi laboratori hanno condiviso i loro protocolli, riassunti in Tabella 2, in cui sono indicati i geni target (cioè i geni che vengono ricercati in rRT-PCR) che ogni gruppo indaga.

Attualmente, sono disponibili anche dei test commerciali validati che, riducendo i tempi di analisi, avvantaggiano i laboratori diagnostici che devono processare un numero elevatissimo di campioni.

Il protocollo inizialmente più utilizzato prevedeva l’indagine di 3 geni: RdRp (RNA-dependent RNA polymerase, E (che produce la proteina E dell’envelope) e N (che produce la proteina N associata all’RNA) [5]. Diversi nuovi protocolli, invece, analizzano solo il gene RdRp, perché è risultato essere quello che accumula meno mutazioni (rendendo più attendibile il risultato del test).

    Tabella 2 – Protocolli disponibili per la diagnosi dell’infezione da SARS-CoV2

Tratta da Coronavirus disease (COVID-19) technical guidance: Laboratory testing for 2019-nCoV in humans. https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/laboratory-guidance

 REFERENZE

 

1. Xu K, Cai H, Shen Y, Ni Q, Chen Y, Hu S, Li J, Wang H, Yu L, Huang H, Qiu Y, Wei G, Fang Q, Zhou J, Sheng J, Liang T, Li L. Management of Corona Virus Disease-19 (COVID-19): the Zhejiang Experience. Jour Zhejiang Univ. 2020.
2. Zhang W, Du RH, Li B, Zheng XS, Yang XL, Hu B, Wang YY, Xiao GF, Yan B, Shi ZL, Zhou P. Molecular and serologicalinvestigation of 2019-nCoV infectedpatients: implication of multiple sheddingroutes. EmergMicrobesInfect. 2020; 9(1):386-389.
3. Yong, Z.; Cao, C.; Shuangli, Z.; Chang, S.; Dongyan, W.; Jingdong, S.; Yang, S.; Wei, Z.; Zijian, F.; Guizhen, W.; Jun, X.; Wenbo, X., Isolation of 2019-nCoV from a Stool Specimen of a Laboratory-Confirmed Case of the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). CCDC Weekly. 2020; 2(8).
4. World Health Organization. Laboratory testing for coronavirus disease 2019 (‎COVID-19)‎ in suspected human cases: interim guidance, 2 March 2020. https://apps.who.int/iris/handle/10665/331329
5. Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, et al.  Detection of 2019 novel coronavirus (SARS-COV2) by real-time RT-PCR. Euro Surveill2020; 25(3): 2000045.